LuminX:Case Study【蛍光性ダイヤモンドでの細胞長期検出】


Theme

細胞外マトリックスとフィブリン接着剤ポリマーを用いたin vivo軟骨形成モデルのヒト脂肪由来幹細胞・間質細胞の長期検出を可能にする蛍光性ナノダイヤモンドの開発

 

Abstract

 臨床的に利用可能な同種の照射肋軟骨やフィブリン糊などの材料は、現行法よりも効率的な治療法の開発を試みるなかでヒト脂肪由来幹細胞(hASCs)のin vivo軟骨分化を行うための足場として使われている。

 

現在、成長因子刺激法、組織工学、生体適合性材料などを用いた研究が行われているが、ほとんどの方法が複雑なプロセスを必要とし、臨床的な限界がある。

 

本報告では、角切りした脱細胞化軟骨細胞外マトリックス(ECM)、hASCs、フィブリン糊ポリマーはヌードマウスの皮下に移植し、脱細胞化軟骨ECMとフィブリン糊ポリマーの移植を受けた対照群、およびhASCsとフィブリン糊ポリマーの混合移植を受けた対照群の2群と結果を比較検討した。

 

異種移植片における生体内軟骨形成の有無を評価するために、hASCsを生体適合性で光安定性のあるナノ材料である蛍光ナノダイヤモンド(FND)で標識し、長期間の検出と組織学的解析を可能にした。

組織学的検査により、実験群では対照群に比べ、細胞性、グリコサミノグリカン、コラーゲンの沈着が増加することが確認された。

 

バックグラウンドフリーの検出技術と時間依存の蛍光イメージングにより、FND標識hASCの数と位置を共焦点顕微鏡で検出することができた。アグリカンやII型コラーゲンなどの軟骨細胞特異的マーカーは、FNDのシグナルを含む細胞と共局在しており、hASCsのin vivoでの軟骨形成を示唆するものであった。

以上のことから、臨床的に利用可能な脱細胞化軟骨ECMとフィブリン糊ポリマーを用いて、ヌードマウスモデルにおいて、in vitroでの軟骨誘導を行わずに、hASCsのin vivoでの軟骨形成が機能的に達成されることが確認された。

 

hASCsのFNDの蛍光シグナルは、ヘマトキシリン・エオジン染色(H&E染色)等の組織学的解析において、自家蛍光の干渉を受けずに検出することができる。本研究は、脱細胞化軟骨ECM、フィブリン糊ポリマー、hASCsの組み合わせによる軟骨修復の臨床応用を将来的に保証するものである。 

 

Introduction

 関節軟骨は、持続的な静的負荷の際に体重を吸収する役割を果たす高度に特殊な組織で、骨が組み合わさって関節を形成している部分のクッションとなっています。細胞の生合成活性が低い無血組織であるため、軟骨の修復能は限られています。

 

外傷や退行性病変による関節軟骨の損傷は、しばしば進行性の劣化をもたらし、関節痛、機能障害、退行性関節炎を引き起こします。損傷した軟骨組織の置換や修復を目的とした外科的介入には、関節鏡下デブリードマン、骨髄刺激法 、軟骨細胞移植、骨軟骨自家移植、骨関節炎由来移植、末期の変性関節病理に対する全関節置換が含まれます。

 

しかし、これらのアプローチの多くは、生化学的、生物力学的にヒアルロン酸関節軟骨より劣る線維軟骨の形成に終わることが多い。自己軟骨細胞移植とその後発アプローチであるマトリックス誘導自己軟骨細胞移植は、臨床的および組織学的結果において大きな期待が持てるが 、グラフト不全、剥離、組織の肥大など多くの有害合併症が報告されている。

 

さらに、自家軟骨細胞の軟骨新生組織再生能力は、患者の年齢やin vitroでの膨張によって低下するため、軟骨修復のための標準的な細胞源とはならない。軟骨病変の修復は、依然として臨床上の重要な問題である。幹細胞を用いた治療法の開発は、細胞治療や再生医療において最も有望な進歩の一つである。骨髄、脂肪、胎盤などの組織に由来する間葉系幹細胞(MSCs)は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞などの複数の系統に分化する能力を持つ自己複製型の多能性前駆細胞として定義されている。hASCは、その入手のしやすさ、自己再生能力、そして軟骨ECMに組み入れられる軟骨特異的マトリックスタンパク質を合成する可能性から、軟骨組織工学のための理想的なソースである。

 

軟骨の組織工学は、足場、細胞、成長因子の添加をターゲットとしていることが、様々な研究により報告されている。同種移植の肋軟骨は、損傷した軟骨組織の外科的再建のための脱細胞化軟骨ECMとして使用することができる。軟骨再生のための脱細胞化軟骨ECM、hASCs、およびフィブリン糊ポリマーの組み合わせは、ドナー部位の病的状態、限られた細胞ソース、および複数の手術などのいくつかの欠点を解決することができる。

 

さらに、フィブリンは、臨床目的の足場として広く応用されており、幹細胞/間質細胞の軟骨分化に適した足場の一つである。フィブリン足場は、その接着性、生体適合性、生分解性から、hASCsの軟骨形成に有用なプラットフォームと適切な環境を提供します。TISSEELは、フィブリノゲン(85 mg/mL)とトロンビン(500 IU/mL)を主成分とし、適用過程で1:1の割合で混合されます。フィニアルフィブリン糊ポリマーの主なタンパク質成分は、フィブリン、フィブロネクチン、アルブミンである。フィブリンは、臨床的に入手可能な脱細胞化軟骨ECMとフィブリン糊ポリマーからなるフィブリン足場は、hASCsのin vivo軟骨形成に理想的な材料となりうる。

 

血栓内の濃度は45 mg/mLである。それ自体が重合し、米国食品医薬品局から止血剤、封鎖剤、接着剤として認可された。我々の実験では、hASCsは脱細胞化軟骨ECMに接着し、異種移植コンストラクトを形成した。

 

生体内における幹細胞の正確な追跡は、再生医療において最も重要な要件の一つである。細胞の追跡は、幹細胞の行き先と最終的な分化の運命の両方を決定するため、これらの治療に関与するメカニズムをより詳細に把握することができる。

 

幹細胞を用いた治療の有効性と安全性を一貫して調査するためには、幹細胞を追跡する方法を開発することが不可欠である。 現在、in vivoでの軟骨形成の研究において、細胞の長期追跡は最も困難なハードルの一つである。蛍光性ナノダイヤモンド(FND]は、in vivoでの軟骨形成研究のための理想的な長期細胞追跡デバイスとなり得る。

 

FNDは炭素ベースのナノ材料であり、並外れた化学的安定性と生物学的不活性を有している。多くの研究により、FNDはクラスリンを介したエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、エキソサイトーシス活性は低いことが実証されている。FND は、イメージプロービングのための新しいナノテクノロジーとして、バイオメディカル研究に広く使用することができる。FND のダイヤモンド格子に存在する負電荷の窒素空孔(NV-)カラーセンターは,光退色やブリンキングのない完璧な光安定性を持つビルトイン蛍光体である。

 

緑黄色光でFNDのNV-中心をレーザー励起すると,NV-中心は安定な遠赤色発光(600-800 nm付近)を示し,蛍光寿命(τ)は15 ns以上であるため,時間ゲート法によるホスト組織からの強い自家蛍光の干渉を回避できる.NV-中心のユニークな磁気光学特性を利用し、バックグラウンドフリーの検出法である磁気変調蛍光(MMF)により、移植細胞の絶対数を定量化することができる。

 

本研究では、FNDで標識されたhASCsは、増殖や分化などの細胞機能に影響を与えなかった。軟骨ECMの脱細胞化、フィブリン糊ポリマー、hASCsからなる実験グループの異種移植片をヌードマウスに植え付けた。FND標識したhASCsは、3ヶ月後の異種移植片で明確に同定され、定量された。実験グループの異種移植片は、コントロールグループと比較して、細胞数と体積が増加していた。

 

さらに、グリコサミノグリカンやコラーゲンの増加も観察された。アグリカンやII型コラーゲンなどの軟骨細胞特異的マーカーは、FNDのシグナルと共局在しており、hASCsのin vivoでの軟骨形成が示唆される。FNDは、細胞分化を起こす可能性のある幹細胞や間葉系細胞の長期的な検出に適用可能である。

 

Results and Discussion

3.1 FNDs Preparation

図 1a に示すように、FNDsは PBS 中で凝集し、培養液中に均質に懸濁することができなかった。そこで、FNDs を蒸留脱イオン水中で 15 分間超音波処理することにより、FNDsと HSA をコンジュゲートした。その後、室温で2時間穏やかに振盪して、FND:HSA≒1:1の重量比でタンパク質と混合し、物理的な吸着を可能にした。遠心分離(15,000rpm、5分間)により未結合のHSAを除去した後、沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。

 

図 1a に示すように、HSA と結合した FND は、FND の蛍光スペクトルに干渉することなく、PBS での FND の凝集を防ぐことができる(図 1b)。FND は、他のナノ粒子と同様に、生理的条件下では沈殿しやすく、細胞を均質に標識することが困難である。材料と方法のセクションで述べたように、強酸化処理でカルボキシル化/酸化された表面官能基を持つFNDは、コロイド安定化剤である血清アルブミンと非共有結合的に相互作用し、FNDの凝集を防ぐことができる。FNDsは、報告されているように脱離することなく血清アルブミンとコンジュゲートした。

 

HSAがhASCs内部に取り込まれたかどうかを調べるために、HSA単独またはFND結合HSAと4時間および6時間インキュベートした後のhASCsのタンパク質溶解物をSDS-PAGEで調べ、クーマシーブルーで染色した。HSA単独またはHSAなしでインキュベートしたhASCsと比較して、FND結合HSAでインキュベートしたhASCsの細胞溶解物中のHSAの増加が認められた(図S4)。これらの結果から、FNDとHSAのコンジュゲーションは安定であり、細胞標識に使用できることが示された。

 

3.2 Characterization of FND - Labeled hASCs

hASCsにロードできるFNDsの数を調べるために、hASCsを指示された時間および濃度でFNDsとインキュベートした。

図2aに示すように、hASCsを100μg/mLのFNDで標識して4時間インキュベートすると、細胞質で多くの赤色蛍光シグナルが認められた。FNDsの蛍光は、NV中心の電子遷移のフォノンサイドバンドに相当する532nmでの励起と685nmでの発光の捕集によって得られた。FNDsはおそらく受容体介在型エンドサイトーシスを介して細胞質内に取り込まれ、顕微鏡で検出される明瞭な蛍光を発するが、これは、FND を呑み込んだ hASC の仮説の可能性を説明するために、以前に報告されているように、呑み込み蛍光の説明のために、顕微鏡で検出されている。

 

さらに、細胞に取り込まれた FNDsの量を定量するためにバックグラウンドフリー検出法を適用した。hASCs を粒子濃度 5-200 μg/mL の FNDsとインキュベートし、その後、培地中の遊離FNDsを除去してから、自作の MMF 分光器で細胞への取り込みを分析した。図 2c に示すように、30 分から 5 時間の間の 6 つの時点で hASCs に取り込まれた FNDsの量は、材料と方法のセクションで説明したように、MMF によって決定することができた。

 

 

3.3. Proliferations and Differentiation of hASCs of Affected by FNDs

FND の蛍光シグナルの強度は用量依存的に増加し、細胞の継代を増やしても、細胞内の FND のシグナルを検出することができた(図 3a)。FND は細胞追跡材料として例示されているため,次に,FND が hASCs において細胞毒性を示すかどうかを調べた。

細胞生存率アッセイであるMTT分析を、FNDで標識した1×105個のhASCsを用いて、1日または5日間のインキュベーションで用量依存的に実施した。細胞毒性および細胞増殖の観点から、各群に有意差は認められなかった(図3b)。FND標識の有無によるhASCsの幹細胞/間質細胞関連特異的表面マーカーの発現パターンを比較するために、フローサイトメトリー解析を行った。

CD29、CD44、CD90、およびCD105の陽性発現が、FNDの存在に関係なくhASCsで観察されたが、CD45については陰性であった(図3c)。FND標識hASCsは、hASCsとして一貫した特徴的な間葉系幹細胞/間葉系細胞(MSC)表現型を有していることが示された。

hASCsの多系統分化能に対するFNDの効果をさらに評価するために、細胞を100μg/mLのFNDとプレインキュベーションし、脂肪形成、骨形成、または軟骨形成誘導培地でそれぞれ3週間培養し、細胞の分化を可能にした。補足図S1aに示すように、FND標識hASCsは、Oil-Red O染色で評価すると、コントロールサンプルと比較して、脂肪形成分化に差を示さなかった。また、FND標識したhASCsは、アリザリンレッドS染色により評価したところ、コントロールサンプルと比較して、骨形成に差が見られなかった(補図S1b)。

Alcian Blueで染色した軟骨分化においても同様の結果が得られ、FND標識hASCsは軟骨分化活性を維持していることが示された。全体として、FND標識hASCsは、脂肪形成、骨形成、および軟骨形成の分化の可能性を維持していることがわかった。

 

3.4. hASCs Maintained the Volume of Xenografts Containing Decellularaized and Fibrin Glue Polymer

In vivo実験では、材料と方法のセクションに記載したように、ECM-接着剤、ECM-hASC-接着剤、hASC-接着剤の3グループの異種移植片を行った。フィブリン糊ポリマーとさいの目に切った脱細胞化軟骨ECMの組み合わせは、異種移植コンストラクトを維持する接着性を有する適切な3D足場として機能した。

 

さらに、フィブリンはその臨床的安全性から、臨床応用に広く用いられている。角切り軟骨ECMを含むフィブリン足場が、in vitroでの誘導なしにhASCsのin vivo軟骨形成が可能かどうかを調べるために、in vitroでの誘導なしに、異種移植片をヌードマウスの皮下層に3ヶ月間移植した(上の図4a)。

 

ECM-hASC-接着剤群の3ヶ月移植後の異種移植片の直径は約12mm(図4a右下)、ECM-接着剤群の3ヶ月移植後の異種移植片の直径は約6mm(図4a左下)であった。3ヶ月後の異種移植片の体積は、ECM-glue群およびECM-hASC-glue群からは、それぞれ元の異種移植片の体積に対して64.09%±15.8および98.97%±17.35であった(図4b)。補足図S2に示すように、hASC-glue群の皮膚上の外観は、移植1ヶ月後に矢印で示すように、平坦であった。

 

hASCが異種移植片の体積維持と関連しているかどうかをさらに検討するために、異種移植片の組織学的分析を行った。図4c,dに示すように、ECM-接着剤と比較してECM-hASC-接着剤群ではDAPIで染色した細胞核の数(青い点)の増加が認められ、hASCがin vivoで異種移植片の体積を著しく維持することができることが示された。近年、サイコロ状の照射軟骨とフィブリン糊の組み合わせが臨床治療に用いられている。しかし、この方法の欠点は、移植片が再吸収されて体積が減少することであり、そのため、臨床結果が満足のいくものでなかった。

 

したがって、幹細胞を用いた治療と足場材を組み合わせた方法は、軟骨形成における有望な戦略の一つとなり得る。そのため、本研究では、ECM単独およびECM-HASCsからなる異種移植片は、フィブリン糊ポリマーなしでは維持することができなかった。本研究で使用したフィブリン糊ポリマーは5日間維持することができ、これは我々の実験における異種移植片コンストラクトの形成に寄与している可能性がある[28]。3ヶ月の実験デザインにおいて、接着剤単独あるいはhASCs単独を実験群に含めると、異種移植片の体積を3ヶ月間維持することができない。

 

hASC-glueの異種移植片は、移植後1ヶ月で消失したが、これは体積維持におけるECMの重要性を物語っているのかもしれない。以上のことから、異種移植片は脱細胞化したECMによって支持され、異種移植片の体積はhASCによって維持される可能性があることが分かった。これらの知見は、軟骨修復における支持体積のメカニズムを理解するための貴重な情報を提供するものであり、臨床応用に重要である。

 

3.5. Long-Term Detection of FND-Labeled hASCs with an In Vivo Chondrogenesis Model 

移植されたFND標識hASCsが異種移植片で検出されるかどうかをさらに確認するために、FNDのユニークな性質を利用してhASCsの追跡を行った。FNDは、蛍光寿命(τ)が15ナノ秒以上のNV-センターを含んでおり、細胞生物学で一般的に使用されている内因性および外因性の蛍光色素の蛍光寿命(τ≒1-4ナノ秒)よりも大幅に長い。

 

H&E 染色を施した脱パラフィン化サンプルを、バックグラウンドフリーの検出を達成するために、時間ゲート共焦点蛍光顕微鏡を用いた FNDs イメージングに使用した。図4eに示すように、脱細胞化ECMの表面周辺にいくつかの細胞核が認められた(図4e(1))。

 

FND標識hASCのシグナルは、共焦点顕微鏡下で強いバックグラウンド蛍光と自家蛍光に干渉された(図4e(2))。FNDのシグナルは、時間ゲート共焦点蛍光顕微鏡を用いて明確に検出することができた(図4e(3))。図4e(4)に示すように、マージした画像は、H&E染色におけるFND標識hASCの位置を明確に示していた。これらの知見を総合すると、FND標識hASCsは、3ヶ月後の異種移植片において、バックグラウンド蛍光の干渉なしに検出され得ることが示された。

 

図4fに示すように、異種移植片における移植されたFND標識hASCsの数は、材料および方法のセクションに記載したように、MMFによって定量化することができる。我々の知る限り、我々の研究は、動物モデルで3ヶ月間FND標識細胞を検出したおそらく最初の実験である。ナノ材料の化学的堅牢性の強みを生かし、FND のユニークな磁気光学特性は依然として維持され、1 ug/mL という低濃度で磁気変調により酸分解物からその蛍光信号を容易に回収することができた。既知量のFNDをマウス組織にスパイクし、同じプロセスで消化することによって決定された回収率は90%以上であった。このような定量分析は、有機色素や蛍光タンパク質のような分子性蛍光体では強酸性で化学的に安定でないため不可能であった。

 

3.6. Functional In Vivo Chondrogenesis

 

すべての標本は組織学的分析のために送られ、グリコサミノグリカンとコラーゲンを検出するためにそれぞれアルシアンブルーとマッソンスリッチクローム染色で処理された。図5aに示すように、アルシアンブルー染色は、ECM-接着剤異種移植片と比較して、ECM-hASC-接着剤異種移植片の間質中の青い染色と赤いドット(細胞核)の増加を示した。

また、Masson's Trichrome染色ではコラーゲン(青色)の増加が確認された。さらに、アルシアンブルーとNuclear Fast Red(赤色)染色による結果では、ECM-glue群に比べECM-hASC-glue群で高い細胞性が認められた。

この結果は、図4cに示すように、我々のこれまでの結果と一致する。これらの知見は、増加したグリコサミノグリカンとコラーゲンが、hASC由来の軟骨細胞様細胞から分泌されている可能性を示唆した。FND標識hASCsが軟骨分化を起こしたかどうかをさらに検証するために、異種移植片のアグリカンとコラーゲンIIの免疫蛍光染色を共焦点顕微鏡で行った。

図5bに示すように、FNDsで標識したhASCs(赤色)とアグリカン(緑色)の共局在が認められた。図5cのコラーゲンII染色でも同様の結果が認められた。FNDsのシグナルとアグリカンやコラーゲンタイプIIを含む軟骨細胞マーカーの共局在は、in vivoで軟骨形成の可能性が示唆された。また、この異種移植片は、3ヶ月後には脱細胞化したECMとフィブリン糊のポリマーを含んでいた。

 

 

Conclusion

本研究は、ECM-接着剤グループと比較して、ECM-hASCs-接着剤グループでは、細胞性が増加し、異種移植コンストラクトの体積がよりよく維持できることを実証している。加えて この研究は、異種移植片の体積をより良く維持できることを実証している。

ECM-hASCs-接着剤群では、マッソントリクローム法で軟骨タンパク質の増加が認められた。ECM-接着剤グループと比較して、ECM-hASCs-接着剤グループでは、細胞性が増加した。アルシアンブルー染色。アグリカンやコラーゲンタイプIIなどの軟骨マーカーのシグナル、さらに、ECM-hASCs-glue群では、軟骨タンパク質の増加がMassonの FNDシグナルと共焦点化し、hASCsのin vivo軟骨形成を示唆している可能性がある。

トリクロム染色とアルシアンブルー染色を含む異種移植片におけるin vivoでのhASCsの軟骨形成を示すかもしれない。アグリカンやコラーゲンなどの軟骨マーカーのシグナルは、細胞検出技術と移植細胞のin vivoでの定量的追跡を組み合わせた方法で、今後の幹細胞/間葉系細胞のトランスレーショナルリサーチにつながる可能性があります。

軟骨ECMとフィブリン糊ポリマーを脱細胞化した。さらに、FNDを導入したタイプIIがFNDシグナルと共局在していることから、異種移植におけるhASCsのin vivoでの軟骨形成が示唆されるかもしれない。



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